基于莱特LF50倒置荧光显微镜在Calcein AM-PI活/死细胞双色荧光染色检测完整解决方案

基于莱特LF50倒置荧光显微镜在Calcein AM-PI活/死细胞双色荧光染色检测完整解决方案

一、方案概述

1.1 Calcein AM-PI 双色染色检测原理

Calcein AM-PI 双染法是细胞原位活力观测经典双色荧光技术，依托细胞酯酶活性与细胞膜完整性双重指标区分活、死细胞：

1. Calcein AM（绿色荧光，FITC 通道，激发 / 发射 494/517nm）

脂溶性小分子，可自由穿透所有细胞膜；活细胞内存在活性酯酶，水解 AM 疏水基团，生成带电荷钙黄绿素滞留细胞质，发出明亮绿色荧光；死细胞无功能性酯酶，无绿色荧光信号。

2. PI 碘化丙啶（红色荧光，TRITC/Cy3 通道，激发 / 发射 535/617nm）

无法穿透完整活细胞膜，仅进入膜破损死细胞，结合细胞核核酸产生红色核荧光。

细胞判定标准：

活细胞：细胞质绿色荧光，细胞核无红色信号；

死细胞：细胞核红色荧光，细胞质无绿色荧光；

晚期凋亡、重度损伤细胞：红绿双荧光阳性。

1.2 LF50 倒置荧光显微镜适配本实验核心硬件优势

莱特 LF50 紧凑型倒置荧光显微镜专为细胞培养原位荧光成像设计，无限远校正光学系统、超长工作距离聚光、电动多通道 LED 荧光系统匹配 Calcein AM-PI 双通道染色观测需求，核心适配亮点如下：

1. 超长可调工作距离聚光系统，兼容全规格细胞培养容器

LF50 聚光镜标准工作距离 72mm，可拆卸拆除后纵向空间可达 160mm，可直接观测多层细胞工厂、大尺寸培养皿、6/12/24 孔板，无需开盖、无需转移爬片，原位染色观测减少细胞脱落损伤，适配高通量细胞活力筛查。

（配图：图 1 LF50 整机正面实拍；图 2 72mm 标准工作距离示意图；图 3 拆卸聚光镜后 160mm 超大空间观测细胞工厂实拍）

LF50整机图

72mm工作距离

聚光镜可拆卸结构

2. 电动五通道 LED 荧光激发盒，精准匹配 Calcein、PI 双染料通道

LF50 搭载集成式电动 LED 荧光激发模块，标配 DAPI、FITC、TRITC 三组标准滤光片组，FITC 通道采集 Calcein 活细胞绿色信号，TRITC 通道采集 PI 死细胞红色信号；LED 光源即开即用无预热，亮度无级可调、光毒性极低，支持长时间活细胞动态追踪拍摄；整机最多扩展 5 组荧光通道，可按需定制 Mcherry、CY5 等滤光片，后续可拓展三色共定位实验。

（配图：图 4 电动荧光激发盒；图 5 Calcein-PI 双色细胞荧光成像效果图）

电动荧光盒

双色荧光成像图

3. 22mm 超大视场三目观察筒，大幅提升样本筛选效率

配备 WF10X/22mm 平场大视场目镜，对比常规 18/20mm 视场目镜，单视野容纳更多细胞，快速定位目标观测区域；30° 可 360° 旋转铰链三目筒，瞳距 48-75mm 大范围可调，高眼点人体工学设计，长时间荧光观测缓解颈肩疲劳；三目分光结构目视观察与数码成像同步进行，无需反复切换光路。

（配图：图 6 360° 旋转三目筒；图 7 18/20/22mm 视场范围对比图）

旋转三目筒

视场对比示意图

4. 大尺寸多功能载物台，柔性低位移动手柄操作便捷

固定载物台尺寸 235×200mm，XY 轴移动行程 123×78mm，搭载可拆卸柔性 XY 低位移动手柄，拆卸后台面平整，可放置超大培养皿；配套多功能培养皿托板，兼容培养瓶、多孔板、细胞工厂；机身配备快拆装荧光护目板，阻挡强激发光保护实验人员眼部。

（配图：图 8 LF50 多功能载物台；图 9 可拆卸移动手柄结构）

多功能载物台

载物台侧视结构

5. 推拉式多通道相差模块，明场 / 相衬 / 荧光三位一体观测

聚光中部双向推拉相差板，同时搭载 10X/20X/40X 三组相差环，染色前可通过相差清晰观察细胞铺板密度、细胞形态；染色后同步采集相差明场、Calcein 绿色、PI 红色三组图像，实现细胞形态 + 细胞活力同步分析，实验数据维度更完整。

（配图：图 10 推拉式相差环板；图 11 相差模式细胞成像图）

相差环推拉板

相差细胞图像

6. 一体化高灵敏度数码成像系统，自动完成活死细胞定量

标准 C-MOUNT 成像接口，支持 230 万 - 2100 万全系列高灵敏度荧光相机，左下侧成像结构不遮挡目视观测；配套专业显微成像软件免费升级，可自动完成双通道图像叠加、活 / 死细胞分割、细胞数量、存活率自动统计，批量导出图像与 Excel 数据报表。

（配图：图 12 LF 系列显微成像相机套装；图 13 相机安装整机实拍）

显微相机套装

相机安装实拍

7. 低手位同步同轴调焦，长时间荧光观测不易失焦

机身左右同步同轴调焦手轮，粗调扭矩松紧可调，配备高程限位锁定功能，微调精度 0.001mm，高倍 40X 荧光物镜观测时对焦稳定，避免反复调焦造成荧光淬灭，适配批量多孔板连续成像。

（配图：图 14 LF50 调焦手轮细节）

调焦手轮

二、实验前期准备

2.1 试剂与耗材清单

1. Calcein AM-PI 活死细胞双色染色试剂盒；

2. 无血清基础培养基（DMEM/RPMI 1640）、细胞培养基；

3. 无菌 PBS 磷酸盐缓冲液；

4. 6 孔、12 孔、24 孔细胞培养板、细胞培养皿、多层细胞工厂；

5. 避光无菌离心管、多通道移液枪、避光孵育盒、无菌吸头。

2.2 LF50 显微镜上机调试操作步骤

1. 整机通电，依次打开机身总电源、透射 LED 照明、电动荧光激发盒电源；LF50 全 LED 光源无需预热，开机即可直接使用。

2. 根据样本规格调整聚光结构：单层多孔板、标准培养皿保留聚光镜（72mm 工作距离）；多层细胞工厂拆卸聚光镜，获得 160mm 超大纵向空间。

3. 推拉相差板至空白档位（明场模式），选用 10X 长工作距离相差物镜，调节同轴调焦手轮至限位归零，锁定高程。

4. 操作电动荧光盒切换 FITC、TRITC 通道预检查，荧光亮度统一调至 30% 基础档位，避免荧光信号过曝丢失细胞细节。

5. 根据培养容器规格安装对应载物托板，拆卸移动手柄放置超大培养皿，固定防滑动卡扣。

三、标准化完整实验操作流程

3.1 贴壁细胞样本预处理

1. 取出完成药物、氧化应激、缺氧等造模处理的细胞培养板，缓慢吸除原有细胞培养基；

2. 加入无菌 PBS 轻柔洗涤细胞单层 1 次，清除血清残留（血清含游离酯酶会提前分解 Calcein AM，大幅提升背景荧光干扰成像）；

3. 洗涤完成后吸净孔内 PBS 残留，防止稀释染色工作液降低染色效率。

3.2 Calcein AM-PI 染色工作液避光配制（现配现用）

以 24 孔板单孔 250μL 体系为例：

取 250μL 无血清培养基，依次加入 Calcein AM 母液、PI 母液，稀释至终浓度 Calcein AM 2~5μM、PI 1~2μM，充分吹打混匀，全程避光操作，配制完成后立即使用。

3.3 细胞避光孵育染色

1. 向每孔细胞中加入配制完成的染色工作液，液体覆盖细胞单层；

2. 将培养板放入 37℃恒温避光细胞孵育箱，避光孵育 15~30min；

3. 悬浮细胞处理方式：离心收集细胞沉淀，使用染色工作液重悬细胞，避光孵育后滴加至培养皿内上机观测。

3.4 LF50 显微镜双通道荧光成像标准操作

1. 样本放置：取出避光孵育完成的细胞培养板，无需再次洗涤（防止贴壁细胞脱落），平稳放置于 LF50 多功能载物台，锁紧托板卡扣防止滑动。

2. 相衬预定位：推拉相差板切换至 10X PH 相差环，开启透射 LED 光源，粗调 + 微调同轴调焦手轮，找到清晰细胞视野，标记目标观测区域。

3. 采集活细胞绿色荧光通道（FITC）：电动荧光盒一键切换 FITC 激发通道，缓慢上调荧光亮度至细胞轮廓清晰无过曝；推拉三目成像切换拉杆切换数码成像模式，采集单通道绿色荧光图像。

4. 采集死细胞红色荧光通道（TRITC）：电动切换 TRITC 激发通道，匹配红色细胞核荧光亮度，采集单通道红色荧光图像。

5. 多通道图像叠加：成像软件自动合并相差明场、绿色 Calcein、红色 PI 三通道图像，直观区分活细胞、死细胞空间分布。

6. 高倍细节拍摄：切换 20X/40X 长工作距离荧光物镜，精细微调对焦，拍摄单细胞活死状态、细胞凋亡细节图像。

3.5 图像采集与细胞活力定量统计分析

1. 打开配套显微成像软件，软件自动识别绿色 Calcein 阳性活细胞、红色 PI 阳性死细胞，自动分割细胞轮廓去除背景杂光；

2. 软件自动统计单视野总细胞数量、活细胞数量、细胞存活率，支持多视野批量数据汇总；

3. 批量保存原始单通道图像、多通道叠加合成图、数据统计报表，一键导出 Excel 实验数据，软件免费升级无额外收费。

四、LF50 设备操作规范与注意事项

1. 荧光观测全程避光：染色样本避免室内强光直射，荧光 LED 亮度由低至高逐步调节，单次观测时间不宜过长，防止 Calcein 荧光淬灭。

2. 聚光镜使用规范：观测多层细胞工厂必须拆卸聚光镜，保证 160mm 纵向空间，避免物镜碰撞培养容器造成硬件损坏；常规单层样本保留聚光镜提升成像亮度。

3. 物镜防护规范：载物台平整结构减少培养液溅落，若液体不慎滴落物镜表面，立即使用专业无尘镜头纸轻轻擦拭，禁止用水直接冲洗物镜镜片。

4. 长时间活细胞动态拍摄优化：降低荧光 LED 输出亮度，缩短图像单次曝光时间；LF50 低光毒性 LED 光源可支持 0.5~1 小时连续动态拍摄，细胞损伤程度极低。

5. 批量多孔板检测优化：电动荧光激发盒支持电脑软件联动自动切换荧光通道，批量多孔样本可设置程序自动轮换通道采集，大幅提升高通量筛查效率。

6. 护目板使用：长时间荧光观测时安装快拆装护目板，阻挡强激发光直射眼部，保护操作人员视力。

五、LF50 搭配 Calcein AM-PI 对比 AOP 染色方案优势

1. 细胞安全性优势：Calcein AM 染料细胞毒性极低，染色完成后的细胞可放回孵箱继续培养开展后续增殖、给药实验；AO 吖啶橙存在遗传毒性，染色后细胞无法复用，LF50 长时间活细胞动态成像仅适配 Calcein AM-PI 检测体系。

2. 成像信号优势：Calcein 均匀标记细胞质，搭配 LF50 22mm 大视场光学系统，可同步观察细胞形态与活力；AO 仅标记细胞核酸，细胞碎片、凋亡小体、游离核酸均会被染色，容易造成细胞计数结果偏高、误差大。

3. 样本兼容优势：LF50 可拆卸超长工作距离聚光系统支持细胞工厂、3D 细胞球、类器官等厚层立体细胞样本原位成像；AOPI 法仅适合悬浮细胞快速计数，无法观测厚层立体细胞模型。

4. 实验拓展优势：LF50 五通道电动荧光模块可额外叠加 DAPI 核染色，实现 Calcein/PI/DAPI 三色荧光共定位，拓展细胞凋亡、共培养细胞活力、干细胞鉴定等多元化检测实验。

六、本方案适用实验场景

本套 LF50 倒置荧光显微镜 + Calcein AM-PI 双染标准化解决方案，适用于以下机构与实验项目：

1. 高校、科研院所细胞生物学实验室：细胞氧化损伤、缺氧模型、药物毒性评价；

2. 药企药效筛选平台：抗肿瘤、细胞保护类药物高通量细胞活力筛查；

3. 干细胞、原代细胞实验室：干细胞活性、原代细胞存活鉴定；

4. 3D 细胞球、类器官、多层细胞工厂高通量培养活力检测；

5. 医疗卫生、检验检疫、农牧乳业细胞相关安全检测项目；

6. 高校教学实验室细胞荧光成像基础教学。

七、LF50 电动荧光标准配置清单

1. LF50 无限远独立校正倒置荧光显微镜主机

2. 30° 可 360° 旋转铰链三目观察筒，瞳距 48-75mm，高眼点设计

3. WF10X/22mm 平场大视目镜，配套对中望远镜

4. 长工作距离平场相差荧光物镜：4X、10X PH、20X PH、40X PH

5. 可拆卸超长工作距离聚光镜，标准 72mm，拆卸后 160mm，N.A 0.30

6. 双向推拉式相差环板，搭载 10X/20X/40X 专用相差环

7. 电动五通道 LED 荧光激发盒，标配 DAPI、FITC、TRITC 三色荧光滤光组

8. 235×200mm 大尺寸多功能载物台，可拆卸柔性 XY 低位移动手柄

9. 5W 可调暖色透射 LED 照明系统，配套黄、绿、蓝滤色片

10. 5/6 孔外倾斜物镜转盘，滚珠内定位，内置防霉装置

11. 2100 万像素高灵敏度荧光显微相机，配套免费成像分析软件

12. 快拆装荧光护目板、全套培养皿 / 多孔板 / 细胞工厂专用托板