CKX53倒置荧光显微镜在活死细胞双色荧光染色(AO-PI法)检测中的应用方案

显微成像解决方案 / 细胞活性评估专栏

奥林巴斯 CKX53 倒置荧光显微镜在活/死细胞双色荧光染色（AO/PI 法）检测中的应用方案

⚡ 基于高信噪比 LED 荧光与无菌超净台适配的规范化细胞分析指南 · 发布时间：2026-07

???? 本文快捷目录与摘要导读 (Table of Contents)

• 01. 方案背景与 AO/PI 双色荧光检测原理（解决原代样品杂质干扰）

• 02. CKX53 倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑（内置 6 张原图解析）

• 03. AO/PI 双色荧光检测 5 步标准化实施流程指南

• 04. 典型图像结果与数据评估（细胞荧光实拍成果图谱）

• 05. 规范操作注意事项与设备保养建议

图1：奥林巴斯CKX53组织培养倒置荧光显微镜整体结构

SECTION 01|方案背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞生物学、药物筛选、肿瘤学评估及原代细胞提取过程中，精准鉴别细胞存活状态是核心检测步骤。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的双色荧光染色法，能够特异性标记质膜完整性。相比于传统台盼蓝明场染色，AO/PI双色荧光法能够有效排除原代样品中的无核红细胞、碎片及杂质干扰，具有更高的检测特异度与准确率。

荧光探针	膜穿透特性	胞内分子靶点与反应机制	激发/发射光谱及 CKX53 适配镜组
吖啶橙 (Acridine Orange, AO) [ 绿色荧光 ]	膜透过型 (脂溶性)	可自由穿透膜结构完整的活细胞与死细胞，与双链 DNA 结合发出强绿色荧光	Ex: 488 nm / Em: 525 nm (匹配 FITC/GFP 绿光镜组)
碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) [ 红色荧光 ]	非膜透过型 (仅透过受损膜)	无法穿透完整活细胞膜；仅当细胞死亡质膜受损时进入胞内，与双链 DNA 结合发出红色荧光（产生 FRET 效应吸收遮盖绿光）	Ex: 535 nm / Em: 617 nm (匹配 TRITC/CY3 红光镜组)

SECTION 02|CKX53 倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑

???? 2.1多通道电动荧光与长寿命大功率LED 集成光源
CKX53配备多达5 个荧光通道观察能力，标准荧光配置包含大功率LED 集成光源与电动控制荧光通道转换。LED光源发光稳定、无预热等待且使用寿命长。匹配高透过高截止带通滤色片镜组（标配FITC、TRITC、DAPI镜组），即便在弱荧光信号下也可获取高对比度、高信噪比的图像。

图1：CKX53电动智能荧光模块

???? 2.2专有“遮光板”（Lighting Shield）设计，实现明亮环境下的荧光观察
传统荧光显微镜强依赖暗室环境，而CKX53专有的遮光板设计可有效阻挡外界光线干扰，增加荧光图像反差，使得实验人员无需关闭实验室照明，直接在明亮环境中即可获取清晰的AO/PI 双色荧光图像。在需要相衬观察时，遮光板可轻易移出光路。

图3：CKX53专有遮光板（Lighting Shield）结构

???? 2.3 整合相衬(iPC) 系统与“反衬”(IVC) 3D 观察技术
CKX53配备iPC 系统，在4X 到40X之间切换物镜时无需更换相衬环即可获得高反差相衬图像，大幅提升定位寻找视野的效率。此外，新研发的反衬（Inversion Contrast, IVC）技术利用更窄的景深，为透明细胞标本提供无光晕、无定向阴影的3D 立体清晰图像。

图3：CKX53预对中iPC滑块与***镜头组

???? 2.4超净台无菌适配与人体工程学设计
CKX53重量仅约7kg，外形紧凑且涂有防紫外涂层，可直接置于超净台内使用超净台紫外灯照射消毒。45度角倾斜光路、前置电源开关与右侧光路切换钮，结合CKX3-MVR 手动载物台，使细胞取样、对焦及拍摄操作顺畅自然。

图5：CKX53超净台无菌观察与紧凑便携机身设计

图6：CKX53灵活承载多孔板、培养皿及培养瓶的通用载物托架

???? 核心配置优势与扩展能力：
• UIS2 (***无限远校正) 光学系统：提供高分辨率与优异的透光性能，确保荧光信号损失极小度化。

• 细胞计数仪 R1 联动扩展：配合细胞计数仪可实现快捷的活/死细胞自动计数，加速整个细胞培养与活性分析流程。

SECTION 03|AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

⚡ STEP 01\|试剂配制与样品洗涤	工作液配制：用 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成工作液（AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），避光保存。样品洗涤：细胞样品用温育的 PBS 洗涤 1–2 次，消除培养基成分及血清干扰。
⚡ STEP 02\|样品混合染色与短时温育	混合染色：按 1:1 比例将工作液与细胞悬液混合（或加至培养孔）。避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。
⚡ STEP 03\|CKX53 快速上样与相衬定位	放置样品：样品放置于 CKX53 载物台上，调节标本夹固定。相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 免换环）或 IVC 模式快速对焦定位。
⚡ STEP 04\|遮光保护与双色荧光采集	展开遮光板：展开 CKX53 专有遮光板，直接遮挡室内环境光。 FITC 通道：切至 FITC 绿光镜组采集活细胞图像。 TRITC 通道：电动切换至 TRITC 红光镜组采集死细胞图像。
⚡ STEP 05\|图像融合与存活率定量评估	数据传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑进行 Overlay/Fusion 叠加。存活率计算：统计全视野内绿光活细胞（Live）与红光死细胞（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

SECTION 04|典型图像结果与数据评估

观察模式/通道	标本荧光形态特征	CKX53 成像优势表现
FITC 通道 (Ex 480-495nm)	活细胞质膜完整，胞质/胞核呈强黄绿荧光	大功率 LED 均匀照明（FN22 大视野），无边缘光衰；透光率高，活细胞形态清晰。
TRITC 通道 (Ex 530-550nm)	死细胞 / 膜受损细胞质膜破损，胞核呈显著红色荧光	高截止带通滤色片有效抑制背景自发荧光，死细胞胞核红光对比度显著，识别准确。
双通道 Fusion 叠加 / 相衬 Overlay	综合存活率评估准确区分活细胞、死细胞及无核杂质	相衬（iPC/IVC）与荧光图谱叠加无位置偏移，遮光板保障明亮环境下高信噪比。

SECTION 05|规范操作注意事项与设备保养建议

???? [ FAQ / TIPS 01 | 孵育时间控制] AO/PI与核酸结合迅速，染色后建议在20分钟内完成观察。时间过长可能导致AO浓度变化或PI被活细胞少量内吞造成假阳性。

???? [ FAQ / TIPS 02 | LED 激发强度调控] 充分利用CKX53电动荧光系统的光源调控功能，在满足对比度的前提下适度调低激发功率，延长荧光抗淬灭时间。

???? [ FAQ / TIPS 03 | 无菌超净台紫外保护] CKX53机身具备防紫外涂层，置于超净台开启紫外灯灭菌前，请盖好物镜防护罩及目镜盖，保护光学镜片防老化。

???? [ FAQ / TIPS 04 | 载物台与部件清洁] 载物台透明中心板如沾染培养基或染色液，应用75%乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，避免有机溶剂残留损伤材质。

⚡ STEP 01\|试剂配制与样品洗涤	工作液配制：用 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成工作液（AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），避光保存。样品洗涤：细胞样品用温育的 PBS 洗涤 1–2 次，消除培养基成分及血清干扰。
⚡ STEP 02\|样品混合染色与短时温育	混合染色：按 1:1 比例将工作液与细胞悬液混合（或加至培养孔）。避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。
⚡ STEP 03\|CKX53 快速上样与相衬定位	放置样品：样品放置于 CKX53 载物台上，调节标本夹固定。相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 免换环）或 IVC 模式快速对焦定位。
⚡ STEP 04\|遮光保护与双色荧光采集	展开遮光板：展开 CKX53 专有遮光板，直接遮挡室内环境光。 FITC 通道：切至 FITC 绿光镜组采集活细胞图像。 TRITC 通道：电动切换至 TRITC 红光镜组采集死细胞图像。
⚡ STEP 05\|图像融合与存活率定量评估	数据传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑进行 Overlay/Fusion 叠加。存活率计算：统计全视野内绿光活细胞（Live）与红光死细胞（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

CKX53倒置荧光显微镜在活死细胞双色荧光染色（AOPI 法）检测中的应用方案

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