CKX53倒置显微镜荧光升级及细胞活力双色荧光染色（AO-PI 法）检测应用方案

???? SOLUTION PORTAL| 细胞生物学与显微成像技术指南

OLYMPUS CKX53 倒置显微镜荧光升级及
活/死细胞双色荧光染色（AO/PI 法）检测应用方案

⚡ 基于 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块 · 排除杂质干扰 · 标准化细胞活性评估指南

[01] 方案背景与 AO/PI 双色荧光检测原理 —BACKGROUND & MECHANISM

在细胞生物学、组织工程、肿瘤学评估及原代细胞提取过程中，精准鉴别细胞存活状态是核心检测步骤。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的双色荧光染色法，能够特异性标记质膜完整性。相较于传统台盼蓝明场染色，AO/PI双色荧光法能够有效排除原代样品中的无核红细胞、细胞碎片及杂质干扰，展现出高的检测特异度与识别准确率：

荧光探针	膜穿透特性	胞内分子靶点与反应机制	激发/发射光谱及适配通道
吖啶橙 (Acridine Orange, AO) (绿色荧光)	膜透过型 (脂溶性)	能够自由穿透膜结构完整的活细胞与死细胞质膜，与双链 DNA 嵌合结合发出强绿色荧光	Ex: 470/35 nm / Em: 525/45 nm (匹配 B 激发组 / FITC)
碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) (红色荧光)	非膜透过型 (仅透过受损膜)	无法穿越膜结构完整的活细胞质膜；仅当细胞死亡质膜破损时穿入胞内，与双链 DNA 嵌合发出红色荧光（产生 FRET 掩盖/吸收绿光）	Ex: 545/25 nm / Em: 605/65 nm (匹配 G 激发组 / TRITC)

[02] CKX53 倒置显微镜荧光升级方案（CKX-UVBG-E 模块） —HARDWARE UPGRADE

图 1：加装 CKX-UVBG-E 模块后的 CKX53 整机结构

???? 高度集成一体化与显微整机结构
常规奥林巴斯 CKX53 显微镜主要用于明场及相衬活细胞观察。通过加装专为 CKX53 量身开发的 CKX-UVBG-E 电动智能荧光模块，无需更换显微镜主体即可快捷升级为高性能倒置荧光显微平台。

图 2：载物台下方的内陷式紧凑安装结构

???? 内陷槽紧凑安装与卡扣设计
CKX-UVBG-E 模块将大功率 LED 光源与荧光激发块高度集成于单一盒体内，采用了内陷安装槽与壳体卡扣设计，结构紧凑且外部固定螺丝少。升级后荧光模块极薄，不遮挡载物台下方空间，确保物镜转换顺畅无阻。

图 3：1.44 英寸彩色显示屏与单指操控旋钮

???? 1.44 英寸彩色大屏与单指防滑多功能操控旋钮
模块配备 1.44 英寸彩色显示屏，以彩色方柱和百分比数值清晰显示当前通道状态及激发光亮度。实体按键与编码标记让通道切换一目了然；配合防滑指压旋钮，单指即可快捷旋转与点击操控，极大提升了实验效率。

图 4：显示控制面板与独立通道激发光指示

???? 长寿命 LED 光源与通道光强智能记忆
采用大功率 LED 光源（使用寿命 > 30,000 小时），即开即用，无需传统高压汞灯繁琐的预热与冷却等待。系统支持多达 4 色独立荧光通道，内置通道光强记忆功能——当在 B 通道（检测 AO 绿光）与 G 通道（检测 PI 红光）之间切换时，模块能自动还原之前设定的光照强度，避免重复微调导致样本荧光淬灭。

???? CKX-UVBG-E 模块升级的核心优势
• 多片透镜高效聚光系统：提供高强度且分布均匀的激发光斑，高品质带通滤光片确保独立通道荧光纯净明亮。

• 丰富通道选配：标配 UV（DAPI）、B（FITC/GFP）、G（TRITC/CY3）三色组，并可选配 Y（mCherry）、R（CY5）等，满足多样化荧光探针需求。

• 低风噪主动循环散热：内置低风噪、低震动风扇进行主动循环风散热，有效保障 LED 灯珠与滤光片的温度稳定，防止光谱中心波峰漂移。

• 软件联动扩展：支持外部协议通讯与软件联动控制，可无缝对接电脑端的图像采集与分析软件。

[03] AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程 —WORKFLOW STEP-BY-STEP

✔ STEP 01\|试剂准备与细胞样品洗涤	工作液配制：使用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成双染色工作液（推荐终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），现配现用并避光保存。样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞，用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及残余血清对荧光染色的干扰。
✔ STEP 02\|样品混合染色与短时温育	染色混合：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例充分混合（或直接加至细胞培养孔中），使染色液均匀覆盖细胞。避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。
✔ STEP 03\|CKX53 上样与明场/相衬快速定位	放置样品：将染色后的血球计数板或培养皿置于 CKX53 载物台上，使用 Universal Holder 固定。相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 切换无需换相衬环）快速寻找代表性视野并完成对焦。
✔ STEP 04\|电动智能荧光通道切换与采集	B 通道采集（活细胞）：通过 CKX-UVBG-E 单指按键一键切换至 B 激发通道（FITC），LED 光源开启，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿光细胞为活细胞）。 G 通道采集（死细胞）：按下按键快速切换至 G 激发通道（TRITC），智能还原预设红光功率，采集红色胞核荧光图像（红光细胞为死细胞/膜受损细胞）。
✔ STEP 05\|图像合成与细胞存活率定量评估	图像传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑，利用配套分析软件对 FITC 绿光通道与 TRITC 红光通道进行 Overlay/Merge 通道叠加。存活率计算：分别统计视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

[04] 典型图像结果与数据评估 —RESULTS & DATA

图 5：双色细胞荧光观察成果图谱

???? 双色细胞荧光检测实拍成果图谱
在 CKX53 优良光学系统与升级后 CKX-UVBG-E 模块的支撑下，获取的高信噪比多色细胞荧光观察成果图谱。图谱清晰展现出分明的形态学与荧光光谱特征，背景对比显著，杂散光干扰极小。

观察模式/通道	标本荧光形态特征	CKX53 升级后成像优势
B 激发通道 (FITC) (Ex 470/35nm)	活细胞质膜完整，胞质/胞核呈亮绿色荧光	大功率 LED 高效聚光，全视野激发均匀；独立带通滤光片使绿光纯洁无杂光。
G 激发通道 (TRITC) (Ex 545/25nm)	死细胞 / 膜受损细胞质膜破损，胞核呈现显著红色荧光	光强记忆功能确保切换无延迟，高截止滤光片有效抑制背景自发荧光，死细胞红核边界清晰。
双通道 Fusion 叠加 / 相衬 Overlay	综合存活率评估准确区分活细胞、死细胞及无核碎片	电动切换顺畅，多通道叠加无焦平面与位置偏离；图像高信噪比为精准计数提供依据。

[05] 规范操作注意事项与设备保养建议 —MAINTENANCE & TIPS

???? [ TIPS 01 | 染色观察时间控制] AO/PI与核酸结合迅速，染色混合后建议在20分钟内完成观察。时间过长可能导致AO 浓度游离变化或PI被活细胞少量吞噬造成假阳性。

???? [ TIPS 02 | LED 激发强度适度调控] 充分利用CKX-UVBG-E模块的无级调光与光强记忆功能，在拍摄对比度满足的前提下适当调低激发功率，减缓荧光探针淬灭。

???? [ TIPS 03 | 风扇风道防堵与清洁] 保证荧光模块侧面主动散热风扇的风道通畅，避免遮挡，定期用干燥气吹清理风扇网罩灰尘。

???? [ TIPS 04 | 镜片与部件擦拭维护] 若载物台或物镜沾染培养基或染色液，应及时用75%乙醇湿润无尘纸轻轻擦拭，保持优良的透光性能与设备卫生。

✔ STEP 01\|试剂准备与细胞样品洗涤	工作液配制：使用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 母液稀释成双染色工作液（推荐终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），现配现用并避光保存。样品洗涤：取待测贴壁或悬浮细胞，用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及残余血清对荧光染色的干扰。
✔ STEP 02\|样品混合染色与短时温育	染色混合：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例充分混合（或直接加至细胞培养孔中），使染色液均匀覆盖细胞。避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与图像采集。
✔ STEP 03\|CKX53 上样与明场/相衬快速定位	放置样品：将染色后的血球计数板或培养皿置于 CKX53 载物台上，使用 Universal Holder 固定。相衬寻焦：开启 LED 明场光源，利用 iPC 整合相衬系统（4X–40X 切换无需换相衬环）快速寻找代表性视野并完成对焦。
✔ STEP 04\|电动智能荧光通道切换与采集	B 通道采集（活细胞）：通过 CKX-UVBG-E 单指按键一键切换至 B 激发通道（FITC），LED 光源开启，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿光细胞为活细胞）。 G 通道采集（死细胞）：按下按键快速切换至 G 激发通道（TRITC），智能还原预设红光功率，采集红色胞核荧光图像（红光细胞为死细胞/膜受损细胞）。
✔ STEP 05\|图像合成与细胞存活率定量评估	图像传输与叠加：通过相机接口将图像传输至电脑，利用配套分析软件对 FITC 绿光通道与 TRITC 红光通道进行 Overlay/Merge 通道叠加。存活率计算：分别统计视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

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