LF200倒置荧光显微镜

在CCK-8细胞活力检测中的应用解决方案

图1 国产莱特LF200倒置荧光显微镜（电动荧光版）

一、方案概述

CCK-8（Cell Counting Kit-8）是目前广泛应用于体外细胞增殖与细胞活力检测的比色实验方法。其原理是在电子载体1-Methoxy PMS存在下，细胞内脱氢酶将CCK-8中的WST-8还原为橙黄色甲瓒产物，产物量与活细胞数量成正比，通过酶标仪测定450nm处吸光度（OD值）即可定量评估细胞活力。

然而，传统酶标仪读取OD值仅能获得群体细胞的整体活力数据，无法直观观察细胞形态、贴壁状态、凋亡细胞形态变化及细胞分布情况。在药物筛选、细胞毒性评价等实验中，单一的OD数值往往不足以全面反映药物对细胞的真实作用。

国产莱特LF200倒置荧光显微镜可结合明场、相差及荧光成像，在CCK-8孵育前后直接对培养板内活细胞进行原位观测，既可以观察细胞形态学变化，搭配电动LED荧光模块还可开展AO-PI活死细胞荧光复染，实现「群体定量（CCK-8 OD值）+细胞原位形态定性」的联合分析，有效弥补单一酶标仪检测的短板，适用于药物筛选、细胞毒性评价、生物医学科研等实验室场景。

本方案适配96孔板、细胞培养皿、细胞工厂等多种培养容器，依托LF200超长工作距离聚光系统、转盘式相差观察、电动5通道LED荧光模块完成整套实验观测流程。

二、实验仪器与试剂

2.1仪器设备

国产莱特LF200倒置荧光显微镜（电动荧光版本），配置WF10X/22mm大视野目镜、10×/20×/40×长工作距离相衬物镜、电动5通道LED荧光激发盒、C-Mount成像接口及显微相机

酶标仪（测定450nm OD值）

CO₂细胞培养箱（37℃、5%CO₂）

超净工作台、离心机、系列移液枪

2.2实验试剂

待测细胞、完全培养基（含血清及双抗）

CCK-8试剂盒

PBS缓冲液

可选：AO-PI活死细胞染色液（荧光复染观测用）

2.3耗材

96孔细胞培养板、细胞培养皿、无菌吸头

三、完整实验操作步骤

实验整体流程：细胞铺板培养 → 药物处理 → LF200显微镜预观测（明场/相差）→ 加入CCK-8孵育 → LF200再次镜检 → 酶标仪读数 →（可选）AO-PI荧光复染观测活死细胞。

步骤1：细胞铺板与培养

将细胞消化、重悬，调整至合适细胞密度，接种至96孔板，设置空白对照组、溶剂对照组及不同浓度给药实验组，每组设3-5个复孔。

将培养板放置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，使细胞贴壁生长（通常过夜培养12-24h）。

待细胞生长至合适汇合度（约50%-70%），加入不同浓度受试药物进行毒性或增殖处理，继续培养设定时间（如24h、48h、72h）。

步骤2：LF200显微镜处理前细胞形态观测（明场+相差模式）

取出96孔培养板，小心转移放置在LF200载物台上，更换适配96孔板的专用托板。LF200配备固定式载物台（227mm×208mm）及移动尺（纵向77mm、横向114mm），可稳定承载培养板并逐孔定位。

图2 LF200载物台及培养容器托板（矩形托板适配96孔板，圆形托板适配培养皿）

LF200设备操作流程如下：

打开主机电源，开启透射LED明场照明光源，调节亮度旋钮至合适照明亮度。LF200采用暖和白色LED光源（5W），亮度可调且预调中，照明均匀。

转动物镜转盘切换至10×相衬物镜。LF200配备5/6孔内定位物镜转盘，滚珠定位，后倾斜设计，带有防霉装置，物镜切换精准顺畅。

图3 LF200五孔内定位物镜转盘（后倾斜设计，滚珠定位）

旋转聚光镜上的相差旋转盘，将对应10×的相差环旋入光路，开启相差观测模式。LF200采用转盘式相差切换，配备4×/10×/20×/40×四组相差环，无需染色即可清晰观察透明活细胞的轮廓与内部结构。

图4 LF200转盘式相差环（图示为10×相差环位置）

双手操作低手位同轴调焦手轮，先粗调快速对焦，再用微调手轮获得清晰细胞图像。微调精度达0.002mm，调焦行程17mm；调焦手轮扭矩可按需调节，并设有限高锁定装置，防止物镜压碰样本。

移动载物台移动尺，逐孔观察孔内细胞贴壁状态、细胞形态、细胞聚集及分布情况。LF200配备WF10X/22mm平场大视野目镜，相比常规18mm/20mm视场，单视场可观察更多细胞，快速评估整孔细胞状态。

图5 WF10X/22mm大视野目镜视场对比（Φ22mm vs Φ20mm vs Φ18mm）

拉动机身右侧观察切换拉杆，可在目镜目视观察与数码相机成像之间切换。通过C-Mount接口（0.5X/1X可选）连接显微相机，配套成像软件拍摄保存各孔细胞相差图像，记录给药前细胞本底状态。

图6 LF200相差模式下活细胞成像效果（无需染色即可清晰观察细胞轮廓）

注意：无需开盖，直接对培养板原位观察即可。LF200聚光镜摆入时工作距离为48-60mm，摆出后***可达172mm，可兼容96孔板、培养皿甚至细胞工厂等较高培养容器，有效减少开盖造成的细胞污染风险。

图7 LF200超长工作距离示意（聚光镜摆出后达172mm，可兼容细胞工厂等高容器）

步骤3：加入CCK-8试剂孵育

显微镜观察完成后，将培养板放回超净工作台，每孔按试剂盒说明书加入CCK-8溶液（通常为培养基体积的1/10，如100μL培养基加10μL CCK-8）。

轻轻敲击培养板侧壁混匀，避免产生气泡，放回细胞培养箱避光孵育（通常1-4h，具体时间需根据细胞类型和密度预实验摸索）。

步骤4：CCK-8孵育后LF200再次镜检

孵育结束后，取出培养板，再次放置于LF200载物台，重复步骤2的明场、相差操作流程，观察给药后细胞形态变化，重点关注细胞皱缩、细胞碎片、漂浮死亡细胞等形态学证据，同步拍摄图像留存。

镜检完成后，将培养板送入酶标仪，测定450nm处OD值（参考波长600-650nm），得到各组细胞活力定量数据。

数据计算：细胞存活率（%）=（给药组OD值 - 空白组OD值）/（对照组OD值 - 空白组OD值）×100%。

步骤5（可选）：AO-PI荧光复染，LF200荧光模式活死细胞成像

如需进一步区分活细胞、凋亡细胞与坏死细胞，可在CCK-8检测后进行AO-PI（吖啶橙-碘化丙啶）荧光复染，利用LF200电动LED荧光模块完成多通道荧光成像，与CCK-8 OD定量结果互相印证。

荧光染色操作：

吸除孔内培养基，PBS轻轻清洗1-2次。

加入AO-PI混合染色液（工作浓度通常AO 5μg/mL、PI 5μg/mL），室温避光孵育5-10min。

吸去染色液，PBS清洗1次，加入少量PBS覆盖细胞，即可上机观察。

LF200荧光模式操作：

开启电动荧光激发盒电源，通道显示屏点亮。LF200电动荧光激发盒将大功率LED光源与激发块内置盒中，电动切换通道，配备通道显示屏、光强记忆、自动开关功能，支持软件控制，***5通道，标配DAPI、FITC（GFP）、TRITC（CY3）三色荧光组。

电动切换激发通道：选择FITC通道（激发波长约488nm）观测AO绿色荧光信号（活细胞），选择TRITC通道（激发波长约532nm）观测PI红色荧光信号（死细胞）。LED光源亮度无级可调，即开即用无需预热，光源寿命长，维护成本低。

物镜切换至对应荧光物镜（LF200可配半复平场消色差荧光物镜4×/10×/20×/40×），调焦获得清晰细胞荧光图像。

通过C-Mount接口连接显微相机，软件采集多通道荧光图片，可直观统计活死细胞比例。左下倾C-Mount成像接口设计，相机安装不干扰目视观察，100%通光率适配弱荧光成像。

图8 LF200 TRITC通道荧光成像效果（橙红色荧光细胞）

图9 LF200多通道荧光叠加成像效果（绿色+橙红色荧光细胞）

四、LF200倒置荧光显微镜在本实验中的核心优势

4.1超长工作距离聚光系统，兼容多种培养容器

LF200配备长工作距离聚光镜（48-60mm，NA 0.30，带可调光栏），聚光镜可摆出，摆出后工作距离***达172mm。96孔板、培养皿、细胞工厂甚至较高的培养容器均可直接原位观测，无需开盖，大幅减少细胞污染风险，同时便于在活细胞培养过程中进行动态观察。

4.2转盘式相差成像，无需染色观察活细胞

LF200采用转盘式相差切换，配备4×/10×/20×/40×四组相差环，配合长工作距离平场消色差相差物镜，无需对细胞进行染色即可清晰观察透明活细胞的轮廓、细胞核及内部结构，非常适合CCK-8实验过程中细胞形态的动态追踪，避免染色对细胞活性的影响。

4.3 WF10X/22mm大视野目镜，提高筛选效率

LF200标配平场大视野目镜WF10X/22mm，相比常规Φ18mm或Φ20mm视场目镜，单视场观察面积显著增大，可在同一视野内观察更多细胞，快速评估整孔细胞状态，在药物筛选等需要逐孔观察的实验中有效提高工作效率。

4.4电动LED荧光系统，多通道活死细胞成像

LF200电动荧光激发盒将大功率LED光源与激发块内置一体化，电动切换通道，配备通道显示屏、光强记忆、自动开关功能，支持软件控制，***5通道。标配DAPI、FITC（GFP）、TRITC（CY3）三色荧光组，可适配AO-PI、Hoechst、Calcein-AM/PI等多种活死细胞染色方案。LED光源即开即用，无需汞灯预热，寿命长、光衰小，维护成本远低于传统汞灯。

4.5人性化低手位操作，长时间实验不易疲劳

LF200采用低手位同轴调焦手轮设计，调焦、光源调节等操作部件集中在低位，实验人员长时间操作不易疲劳。载物台移动尺带极限自动保护，防止样本碰撞损坏；调焦手轮设有限位和锁紧装置，微调精度0.002mm，操作精准舒适。

4.6强大数字化扩展，实现定量与定性数据关联

LF200配备0.5X/1X C-MOUNT国际标准成像接口，可搭配230-2500万像素高画质显微相机或高速相机（1000-1000000帧/秒），配套软件实现图像采集、存档及简单图像分析。左下倾C-Mount接口设计使相机安装不干扰目视观察，100%通光率适配弱荧光成像，可实现细胞形态图片与CCK-8定量OD值的一一对应归档。

图10 LF200长工作距离平场消色差物镜系列（4×/10×/20×/40×/60×）

五、实验注意事项

活细胞观测时应尽量缩短开盖时间，减少污染风险；荧光观测时尽量缩短激发光照射时间，避免光毒性损伤活细胞。

CCK-8孵育时间需根据细胞类型和细胞密度预实验摸索，孵育过久会造成背景升高、线性关系变差。

96孔板观测务必使用配套专用托板，保证载物台平稳；物镜转换时注意观察，避免镜头触碰培养板底部。

荧光通道切换后，建议确认滤光片到位再进行拍照，以保障成像信噪比；多通道成像时注意各通道曝光时间的一致性。

AO-PI染色后应尽快观察，染色时间过长可能导致活细胞着色增强，影响活死细胞判读准确性。

实验需设置空白对照（无细胞、加CCK-8）、溶剂对照（加溶剂、加CCK-8），以扣除背景和溶剂影响。

六、方案总结

本方案将CCK-8比色定量检测与莱特LF200倒置荧光显微镜的形态学观察及荧光成像有机结合。酶标仪给出群体细胞活力的OD定量值，LF200倒置荧光显微镜提供单孔原位细胞形态证据及活死细胞荧光成像，实现「定量+定性」的联合分析。

在药物细胞毒性筛选、化合物活性评价、细胞增殖实验等场景中，本方案可有效规避单一酶标仪只能获得数值、看不到细胞真实状态的缺陷，帮助研究人员更全面、更准确地评估药物对细胞的作用效果。LF200凭借超长工作距离、大视野目镜、电动LED荧光系统及人性化操作设计，是细胞生物学实验室开展CCK-8等细胞活力检测的理想配套设备。

适用于科研院所、药企筛选实验室、高校细胞生物学实验室、生物医学研究机构等单位。