ECLIPSE Ts2-FL 倒置荧光显微镜在活/死细胞双色荧光染色（Calcein AM / PI 法）中的应用解决方案

Calcein AM
(活细胞特异性标记)

细胞膜透过型
(脂溶性疏水分子)

无荧光的 Calcein AM 穿透活细胞膜进入胞质，被胞内非特异性酯酶水解为带强负电荷极性荧光素 Calcein，完全滞留胞质发出亮绿色荧光。

Ex: 494 nm / Em: 517 nm
匹配 GFP / FITC 通道

Propidium Iodide (PI)
(死细胞特异性标记)

非膜透过型
(仅入破损受损细胞)

无法穿透完整活细胞膜；当细胞死亡或质膜破损时穿入胞内，特异性嵌合于双链 DNA 碱基对中，荧光增强 20–30 倍，发出显著红色荧光。

Ex: 535 nm / Em: 617 nm
匹配 TRITC / Texas Red

步骤 2：细胞处理与原位避光孵育

取待测细胞培养板（如 96 孔板或 35 mm 培养皿），吸除培养基，用温育 PBS 轻轻清洗 1 次以去除血清酯酶干扰。加入配制好的双染工作液覆盖细胞层，置于 37°C、5% CO₂ 培养箱中避光温育 15–20 分钟。

步骤 3：Ts2-FL 上样与相差/浮雕反差快速定位

将细胞皿/板置于 Ts2-FL 专用托板（如 C-S-HP35 或多孔板托板）上。开启透射 LED，利用切跖相差（APC）或浮雕反差模式，在 10X/20X 物镜下快速锁定视野并调焦。

步骤 4：展开遮光板与双通道快速荧光采集

展开机身自带遮光板（Shield Plate）屏蔽室内杂光。切换至 GFP/FITC 通道（系统自动恢复预设光强），采集 Calcein AM 绿色胞质荧光（活细胞）；随后切换至 TRITC 通道，采集 PI 红色胞核荧光（死细胞）。

步骤 5：NIS-Elements 多通道图像融合与定量分析

通过显微镜侧端口 Digital Sight 相机传输图像。在 NIS-Elements 软件中执行多通道融合（Fusion），并调用自动计数模块精确输出活细胞数、死细胞数及存活百分比。

• 优化 LED 激发光强： 充分发挥 Ts2-FL 的光强记忆优势，在满足相机曝光信噪比的前提下设定适宜功率（建议 20%–40%），***限度减缓光漂白与光毒性。

• 遮光板使用与机身清洁： 在明亮实验室观察时务必展开遮光板；载物台若沾染培养基或染液应立即用湿润无尘纸轻拭，避免盐结晶腐蚀表面。

• 光学镜头专业维护： 定期检查 10X/20X/40X 长工作距离荧光物镜前透镜。若有灰尘或油污，需用专用镜头纸蘸取无水乙醇由中心向外螺旋单向擦拭。