基于LF50倒置荧光显微镜的活/死细胞双重荧光染色检测（AO/PI 法）应用解决方案

基于LF50倒置荧光显微镜在活/死细胞
双色荧光染色（AO/PI 法）检测中的应用解决方案

基于紧凑型 LED 荧光激发与直立三目数码观察的规范化细胞活性评估指南

图 1：莱特 LF50 倒置荧光显微镜整机结构与数码成像系统

一、 应用背景与 AO/PI 双色荧光检测原理

在细胞毒理学、原代细胞分离提取、免疫学评估及细胞工程研究中，精准测定细胞悬液或培养物中的活细胞与死细胞比例是核心环节。吖啶橙（Acridine Orange, AO）与碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）联合使用的 AO/PI 双色荧光染色法，能够特异性鉴定细胞质膜的完整性。相比于传统台盼蓝（Trypan Blue）明场染色，AO/PI 染色法能有效排除原代样品中的无核碎片、红细胞及杂质干扰，大幅提升计算结果的准确性。

1.1 AO 与 PI 荧光探针的作用机制

二、 LF50倒置荧光显微镜核心硬件与技术支撑

莱特 LF50 倒置荧光显微镜采用无限远独立校正光学系统与高稳定性结构设计，为 AO/PI 荧光活死细胞检测提供了契合的技术硬件支撑：

2.1 紧凑光源/激发一体化 LED 荧光系统（手动/电动可选）

LF50 采用了光源与激发块一体化的紧凑型 LED 荧光激发盒，内置大功率高亮 LED 光源，支持无级调光，可实现即开即用（无传统汞灯预热与冷却等待的困扰）。系统最多支持 5 通道扩展，标配包含 FITC（GFP）、TRITC（CY3）及 DAPI 三色滤光组，能够准确匹配 AO（绿色）与 PI（红色）的激发和发射波长。电动款激发盒还配有液晶显示屏，支持光强记忆与软件控制。

图 2：LF50 紧凑光源/激发一体化 LED 荧光激发盒（带无级调光与通道显示）

图 3：LF50 匹配的高透光率 FITC / TRITC / DAPI 荧光滤光块

2.2 72mm 超长工作距离聚光镜与护目板设计

LF50 配备 72mm 超长工作距离聚光镜（数值孔径 N.A. 0.30），带可调光栏与非球面镜片，提供均匀一致的相衬照明。当拆卸聚光镜后，纵向工作空间可拓展至 160mm，方便直接承载大型培养皿或细胞工厂。此外，LF50 配有快拆装护目板，能有效滤除强激发光的反射，保护实验人员的眼睛。

图 4：LF50 护目板与 72mm 超长工作距离聚光系统

2.3 30° 倾斜三目观察筒与 0.001mm 高精度低手位调焦

LF50 配备 30° 倾斜铰链式三目观察筒，支持 360° 旋转与大范围瞳距调节（48–75mm），配合 WF10X/22mm 平场大视野目镜，提供舒适的观视体验。调焦机构采用左右同轴低手位手轮，微调精度高达 0.001mm（行程 15mm），带限位与锁紧装置，可实现快速精准对焦。

图 5：LF50 30° 倾斜三目筒与低手位同轴调焦机构

2.4 直立顶置三码接口与高画质显微相机

LF50 采用直立顶置三目 C-MOUNT 成像接口（分光比 0:100 / 100:0），支持挂载 230–2500 万像素高灵敏度数码显微相机。结合专用配套软件，可实现电脑端实时预览、低照度荧光图像采集及自动化图像叠加分析。

图 6：LF50 顶置三目接口连接高画质数码显微相机

三、 AO/PI 双色荧光检测标准解决方案流程

为了在 LF50 显微镜下获得低背景噪声、对比度清晰的双色荧光图像及准确的细胞活性数据，推荐采用以下标准化操作流程：

步骤 1：试剂配制与样品准备

• 工作液配制：使用无荧光背景的 PBS 缓冲液将 AO 与 PI 储存液稀释为双染色工作液（建议终浓度：AO 约 5–10 μg/mL，PI 约 10–20 μg/mL），避光保存，现配现用。

• 细胞洗涤：取待测贴壁细胞、悬浮细胞或原代悬液，用温育的 PBS 轻轻洗涤 1–2 次，消除培养基成分及残余血清干扰。

步骤 2：样品混合染色与孵育

• 混合染色：将 AO/PI 混合工作液与细胞悬液按 1:1 比例充分混合（或直接加入培养板孔中），确保染色液均匀覆盖细胞。

• 避光温育：室温避光孵育 5–10 分钟。由于 AO/PI 与核酸结合迅速，建议在 20 分钟内完成上样与采集。

步骤 3：LF50 快速上样与相衬聚焦

• 样品放置：将染色后的血球计数板、载玻片或培养皿置于 LF50 载物台上，使用加粗固定夹固定。

• 明场/相衬定位：开启 LED 明场光源，推动相差板切入对应相衬环（如 10X 或 20X），利用 0.001mm 高精度微调手轮快速找到代表性视野焦面。

步骤 4：多通道荧光图像采集

• FITC 通道采集（活细胞）：将荧光激发盒切换至 FITC 绿光通道，开启 LED 荧光激发，采集绿色胞质/胞核荧光图像（绿光细胞为活细胞）。

• TRITC 通道采集（死细胞）：切换至 TRITC 红光通道，系统还原预设光强，采集红色胞核荧光图像（红光细胞为死细胞/膜受损细胞）。

步骤 5：图像合成与细胞存活率分析

• 图像传输与叠加：通过顶置三目接口挂载的显微相机传输数据，利用配套软件对 FITC 与 TRITC 图像进行 Overlay/Merge 通道叠加。

• 活性定量计算：分别统计全视野内的绿光活细胞数（Live）与红光死细胞数（Dead），计算细胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型图像结果与数据评估

在 LF50 高质光学系统与高信噪比 LED 荧光光路支持下，AO/PI 染色呈现出界限分明的形态与光谱特征：

图 7：LF50 下采集的高信噪比多通道细胞荧光图谱（亮视野与低背景噪点）

五、 规范操作注意事项与设备保养建议

5.1 染色时间控制：染色混合后建议在 20 分钟内完成荧光观察与图像采集。孵育时间过长可能导致 AO 浓度变化或 PI 被活细胞内吞造成假阳性。

5.2 激发光功率调节：利用 LF50 荧光激发盒的无级调光与光强记忆功能，在拍摄强度满足的前提下适当调低 LED 激发功率，以减缓荧光漂白。

5.3 护目板规范使用：在强激发光观察时请拉出护目板，保护实验人员视力健康。

5.4 镜片维护保养：半复平场消色差物镜透镜表面需定期检查，若沾有灰尘或培养基，应用气吹或专用的无尘纸沾取无水乙醇轻轻擦拭，保持优良的透光性能。