LF200倒置荧光显微镜Calcein AM-PI法活死细胞双色荧光染色检测完整解决方案

LF200倒置荧光显微镜活/死细胞双色荧光染色检测（Calcein AM-PI法）完整解决方案

一、方案概述

1. 检测原理

Calcein AM-PI 双染法是经典活细胞活力检测技术：

• Calcein AM（绿色荧光，FITC 通道 Ex/Em 494/517nm）：脂溶性小分子穿透完整细胞膜，活细胞内酯酶水解 AM 基团生成带电荷钙黄绿素，滞留细胞质发出明亮绿色荧光；死细胞无功能性酯酶，无绿色信号。

• PI（红色荧光，TRITC 通道 Ex/Em 535/617nm）：无法穿透完整细胞膜，仅进入膜破损死细胞，结合细胞核核酸发出红色荧光。

判定标准：

✅ 活细胞：胞质绿色荧光、无红色核信号

❌ 死细胞：细胞核红色荧光、无绿色胞质信号

⚠️ 晚期凋亡 / 膜损伤细胞：红绿双阳性

2. 设备选型：莱特 LF200 倒置荧光显微镜核心适配优势

LF200整机正面

LF200整机侧视

广州市莱特光电 LF200 系列无限远校正倒置荧光显微镜，适配 Calcein AM-PI 原位活细胞成像，核心硬件优势匹配染色检测需求：

1. 超长工作距离聚光系统，兼容各类细胞培养容器

聚光镜支持48–60mm（单层培养皿）与172mm（细胞工厂 / 多层高通量培养器）两种工作距离，无需开盖即可直接观察贴壁细胞、3D 细胞球、细胞工厂样本，原位染色无需爬片转移，减少细胞损伤。

172mm超长工作距离

48-60mm标准工作距离

2. 电动 LED 多通道荧光激发盒，匹配 Calcein/PI 双通道

集成电动荧光激发模块，标配FITC（Calcein 绿色）、TRITC（PI 红色）、DAPI三组滤光通道，电动一键切换激发波段，LED 光源即开即用、无需预热，亮度无级可调，低光毒性适配长时间活细胞动态观察，规避传统汞灯高温损伤细胞样本。

电动荧光激发盒

Calcein-PI双色荧光成像效果

3. 大视野人体工学观察系统，提升样本筛选效率

10×/22mm 超大视场目镜（对比常规 18/20mm 视野），单视野容纳更多细胞；45° 铰链倾斜双目镜筒，长时间观察颈椎无疲劳；低手位同轴调焦手轮，扭矩可调带限位锁，高倍荧光成像不易失焦。

45°倾斜双目镜筒

22mm大视场对比示意图

4. 多功能柔性载物台，适配多规格培养器皿

同轴钢丝传动移动尺，移动平稳带极限保护；配套 6 孔 / 12 孔 / 24 孔板、培养皿、细胞工厂专用托板，台面凹槽防培养液溅落物镜；可拆卸移动尺，台面平整无遮挡，荧光成像无杂散光干扰。

多功能载物台托板

载物台防溅凹槽

5. 全配套成像系统，定量分析一体化

支持 230 万–2100 万高灵敏度显微相机，左下倾 100% 通光成像接口，相机安装不遮挡目视观察；配套免费升级成像软件，可双通道自动采集、分割活 / 死细胞、自动统计细胞存活率。

LF系列显微成像相机

6. 明场 + 相衬 + 荧光三合一，一机完成全流程观察

旋转式相差转盘，10×/20×/40× 相衬环一键切换，染色前可通过相衬观察细胞铺板状态，染色后同步采集相衬明场 + 双色荧光图像，实现细胞形态 + 活力同步分析。

二、实验前准备

（一）试剂耗材

1. Calcein AM-PI 活死细胞双染试剂盒

2. 无血清 DMEM/RPMI 培养基、无菌 PBS 缓冲液

3. 6/12/24 孔细胞培养板、细胞培养皿、细胞工厂

4. 无菌避光离心管、移液器、避光孵育盒

（二）LF200 显微镜设备准备

1. 整机通电，开启机身总电源、透射 LED 光源、电动荧光激发盒；LED 光源无需预热，直接使用。

2. 根据培养容器选择聚光镜档位：单层培养皿摆入聚光镜（48–60mm）；细胞工厂摆出聚光镜（172mm）。

3. 旋转相差转盘至 0 档（明场），选用 10× 长工作距离平场物镜，低手位调焦手轮归零限位。

4. 电动荧光盒切换通道预检查：FITC（绿色）、TRITC（红色）通道亮度调至 30% 基础亮度。

5. 安装对应规格培养皿托板，固定载物台移动尺。

三、标准化实验操作全流程（贴壁细胞原位染色，适配 LF200 直接观察）

步骤 1：细胞样本预处理

1. 取出药物 / 造模处理后的贴壁细胞培养板，轻柔吸除培养基，无菌 PBS 缓慢洗涤细胞 1 次，去除血清残留酯酶（血清酯酶会分解 Calcein AM 造成背景荧光升高）。

2. 洗涤后吸净 PBS，避免残留稀释染色工作液。

步骤 2：Calcein AM-PI 染色工作液配制（现配现用，避光）

以 24 孔板单孔为例：

取 250μL 无血清培养基，加入 Calcein AM 母液至终浓度 2–5μM，PI 母液至终浓度 1–2μM，充分吹打混匀，全程避光操作。

步骤 3：避光孵育染色

1. 每孔加入配制好的染色工作液，覆盖细胞单层；

2. 培养板置于 37℃避光孵育箱，孵育 15–30min；悬浮细胞可离心重悬染色，孵育后滴加至培养皿观察。

步骤 4：LF200 倒置荧光显微镜成像检测（核心操作）

细胞相衬原图

1. 放置样本：取出染色完成的培养板，无需洗涤（减少细胞脱落），平稳放置于 LF200 多功能载物台，固定托板防止滑动。

2. 相衬预定位：旋转相差转盘至对应物镜相衬环（10×PH），开启透射 LED 光源，低手位调焦手轮粗调 + 微调，找到清晰细胞视野，记录细胞分布区域。

3. 绿色活细胞通道采集（FITC）

电动荧光盒一键切换 FITC 激发通道，调节 LED 荧光亮度至荧光信号清晰、无过曝；推拉成像切换拉杆，目视观察后切换数码成像模式，采集单通道绿色荧光图（活细胞胞质亮绿）。

4. 红色死细胞通道采集（TRITC）

电动切换 TRITC 激发通道，调整亮度匹配红色核信号，采集单通道红色荧光图（死细胞核亮红）。

5. 多通道叠加成像：软件自动合并相衬明场、绿色、红色三通道图像，直观区分活 / 死细胞位置。

6. 高倍细节观察：切换 20×/40× 长工作距离荧光物镜，微调焦，拍摄单细胞活死状态细节图像。

步骤 5：图像定量分析

1. 成像软件自动分割绿色阳性活细胞、红色阳性死细胞；

2. 统计总细胞数、活细胞数量、细胞存活率；

3. 批量保存原始图像、叠加图、数据报表，软件导出实验数据。

四、LF200 设备操作关键注意事项

1. 荧光观察避光：染色样本全程避光，LED 荧光亮度由低到高调节，避免强光长时间照射导致荧光淬灭。

2. 聚光镜适配规范：多层细胞工厂必须将聚光镜摆出（172mm 工作距离），否则物镜触碰培养容器造成设备损伤。

3. 物镜保护：载物台凹槽设计可阻挡培养液溅落物镜，若液体滴落物镜，立即用无尘镜头纸擦拭。

4. 长时间活细胞动态观测：降低荧光 LED 亮度，缩短单次曝光时间，LF200 低毒 LED 光源可支持 0.5–2h 连续动态拍摄，无明显细胞光毒性。

5. 通道切换逻辑：电动荧光盒支持软件联动控制，批量多孔板检测可设置通道自动轮换，提升高通量样本检测效率。

五、方案对比优势（Calcein AM-PI 法搭配 LF200 vs AOPI 法）

1. 细胞安全性：Calcein AM 低细胞毒性，染色后细胞可继续培养；AO 具有遗传毒性，染色样本不可复用，LF200 长时成像仅适配 Calcein AM-PI 体系。

2. 成像维度：Calcein 标记细胞质，LF200 大视场可同步观察细胞形态 + 活力；AO 仅标记核酸，碎片、凋亡小体易造成计数干扰。

3. 样本兼容性：LF200 超长工作距离支持细胞工厂、3D 球原位 Calcein 染色成像；AOPI 多用于悬浮细胞快速计数，不适合厚层立体样本。

4. 实验拓展：LF200 五通道荧光模块可叠加 DAPI 核染，实现 Calcein/PI/DAPI 三色共定位，拓展凋亡、共培养细胞检测。

六、应用场景

本套 LF200+Calcein AM-PI 方案广泛适用于：

1. 药物细胞毒性、抗肿瘤药物筛选；

2. 干细胞、原代细胞活力鉴定；

3. 3D 细胞球、类器官、细胞工厂高通量活力检测；

4. 细胞缺氧、氧化应激损伤模型评价；

5. 科研院所、高校细胞生物学实验室、药企药效评价平台。

七、设备配置清单（LF200 电动荧光标准配置）

1. LF200 无限远校正倒置荧光显微镜主机

2. 45° 铰链式双目镜筒，WF10×/22mm 大视场目镜

3. 长工作距离平场相差荧光物镜：4×、10×PH、20×PH、40×PH

4. 旋转摆入式长工作距离聚光镜（48–172mm 可调）

5. 转盘式相差模块（10/20/40× 相衬环）

6. 电动五通道 LED 荧光激发盒（标配 FITC/TRITC/DAPI）

7. 多功能柔性移动载物台 + 全套培养皿 / 多孔板托板

8. 2100 万高灵敏度荧光显微相机 + 成像分析软件

9. 5W 可调暖色透射 LED 照明系统

八、方案总结

莱特 LF200 倒置荧光显微镜依托超长工作距离、电动多通道 LED 荧光、大视野人体工学光学系统、一体化数码成像四大核心硬件优势，匹配 Calcein AM-PI 活死细胞双色染色原位成像需求，整套方案实现样本原位染色→相衬定位→双通道荧光采集→细胞活力定量分析全流程标准化操作，兼顾高通量培养容器、3D 立体细胞样本、长时间活细胞动态观测场景，相比进口倒置荧光设备具备高性价比、国产化售后、软件终身免费升级等优势，是细胞活力检测实验的一站式成像解决方案。

一、方案概述

1. 检测原理

Calcein AM-PI 双染法是经典活细胞活力检测技术：

• Calcein AM（绿色荧光，FITC 通道 Ex/Em 494/517nm）：脂溶性小分子穿透完整细胞膜，活细胞内酯酶水解 AM 基团生成带电荷钙黄绿素，滞留细胞质发出明亮绿色荧光；死细胞无功能性酯酶，无绿色信号。

• PI（红色荧光，TRITC 通道 Ex/Em 535/617nm）：无法穿透完整细胞膜，仅进入膜破损死细胞，结合细胞核核酸发出红色荧光。

判定标准：

✅ 活细胞：胞质绿色荧光、无红色核信号

❌ 死细胞：细胞核红色荧光、无绿色胞质信号

⚠️ 晚期凋亡 / 膜损伤细胞：红绿双阳性

2. 设备选型：莱特 LF200 倒置荧光显微镜核心适配优势

LF200整机正面

LF200整机侧视

广州市莱特光电 LF200 系列无限远校正倒置荧光显微镜，适配 Calcein AM-PI 原位活细胞成像，核心硬件优势匹配染色检测需求：

1. 超长工作距离聚光系统，兼容各类细胞培养容器

聚光镜支持48–60mm（单层培养皿）与172mm（细胞工厂 / 多层高通量培养器）两种工作距离，无需开盖即可直接观察贴壁细胞、3D 细胞球、细胞工厂样本，原位染色无需爬片转移，减少细胞损伤。

172mm超长工作距离

48-60mm标准工作距离

2. 电动 LED 多通道荧光激发盒，匹配 Calcein/PI 双通道

集成电动荧光激发模块，标配FITC（Calcein 绿色）、TRITC（PI 红色）、DAPI三组滤光通道，电动一键切换激发波段，LED 光源即开即用、无需预热，亮度无级可调，低光毒性适配长时间活细胞动态观察，规避传统汞灯高温损伤细胞样本。

电动荧光激发盒

Calcein-PI双色荧光成像效果

3. 大视野人体工学观察系统，提升样本筛选效率

10×/22mm 超大视场目镜（对比常规 18/20mm 视野），单视野容纳更多细胞；45° 铰链倾斜双目镜筒，长时间观察颈椎无疲劳；低手位同轴调焦手轮，扭矩可调带限位锁，高倍荧光成像不易失焦。

45°倾斜双目镜筒

22mm大视场对比示意图

4. 多功能柔性载物台，适配多规格培养器皿

同轴钢丝传动移动尺，移动平稳带极限保护；配套 6 孔 / 12 孔 / 24 孔板、培养皿、细胞工厂专用托板，台面凹槽防培养液溅落物镜；可拆卸移动尺，台面平整无遮挡，荧光成像无杂散光干扰。

多功能载物台托板

载物台防溅凹槽

5. 全配套成像系统，定量分析一体化

支持 230 万–2100 万高灵敏度显微相机，左下倾 100% 通光成像接口，相机安装不遮挡目视观察；配套免费升级成像软件，可双通道自动采集、分割活 / 死细胞、自动统计细胞存活率。

LF系列显微成像相机

6. 明场 + 相衬 + 荧光三合一，一机完成全流程观察

旋转式相差转盘，10×/20×/40× 相衬环一键切换，染色前可通过相衬观察细胞铺板状态，染色后同步采集相衬明场 + 双色荧光图像，实现细胞形态 + 活力同步分析。

二、实验前准备

（一）试剂耗材

1. Calcein AM-PI 活死细胞双染试剂盒

2. 无血清 DMEM/RPMI 培养基、无菌 PBS 缓冲液

3. 6/12/24 孔细胞培养板、细胞培养皿、细胞工厂

4. 无菌避光离心管、移液器、避光孵育盒

（二）LF200 显微镜设备准备

1. 整机通电，开启机身总电源、透射 LED 光源、电动荧光激发盒；LED 光源无需预热，直接使用。

2. 根据培养容器选择聚光镜档位：单层培养皿摆入聚光镜（48–60mm）；细胞工厂摆出聚光镜（172mm）。

3. 旋转相差转盘至 0 档（明场），选用 10× 长工作距离平场物镜，低手位调焦手轮归零限位。

4. 电动荧光盒切换通道预检查：FITC（绿色）、TRITC（红色）通道亮度调至 30% 基础亮度。

5. 安装对应规格培养皿托板，固定载物台移动尺。

三、标准化实验操作全流程（贴壁细胞原位染色，适配 LF200 直接观察）

步骤 1：细胞样本预处理

1. 取出药物 / 造模处理后的贴壁细胞培养板，轻柔吸除培养基，无菌 PBS 缓慢洗涤细胞 1 次，去除血清残留酯酶（血清酯酶会分解 Calcein AM 造成背景荧光升高）。

2. 洗涤后吸净 PBS，避免残留稀释染色工作液。

步骤 2：Calcein AM-PI 染色工作液配制（现配现用，避光）

以 24 孔板单孔为例：

取 250μL 无血清培养基，加入 Calcein AM 母液至终浓度 2–5μM，PI 母液至终浓度 1–2μM，充分吹打混匀，全程避光操作。

步骤 3：避光孵育染色

1. 每孔加入配制好的染色工作液，覆盖细胞单层；

2. 培养板置于 37℃避光孵育箱，孵育 15–30min；悬浮细胞可离心重悬染色，孵育后滴加至培养皿观察。

步骤 4：LF200 倒置荧光显微镜成像检测（核心操作）

细胞相衬原图

1. 放置样本：取出染色完成的培养板，无需洗涤（减少细胞脱落），平稳放置于 LF200 多功能载物台，固定托板防止滑动。

2. 相衬预定位：旋转相差转盘至对应物镜相衬环（10×PH），开启透射 LED 光源，低手位调焦手轮粗调 + 微调，找到清晰细胞视野，记录细胞分布区域。

3. 绿色活细胞通道采集（FITC）

电动荧光盒一键切换 FITC 激发通道，调节 LED 荧光亮度至荧光信号清晰、无过曝；推拉成像切换拉杆，目视观察后切换数码成像模式，采集单通道绿色荧光图（活细胞胞质亮绿）。

4. 红色死细胞通道采集（TRITC）

电动切换 TRITC 激发通道，调整亮度匹配红色核信号，采集单通道红色荧光图（死细胞核亮红）。

5. 多通道叠加成像：软件自动合并相衬明场、绿色、红色三通道图像，直观区分活 / 死细胞位置。

6. 高倍细节观察：切换 20×/40× 长工作距离荧光物镜，微调焦，拍摄单细胞活死状态细节图像。

步骤 5：图像定量分析

1. 成像软件自动分割绿色阳性活细胞、红色阳性死细胞；

2. 统计总细胞数、活细胞数量、细胞存活率；

3. 批量保存原始图像、叠加图、数据报表，软件导出实验数据。

四、LF200 设备操作关键注意事项

1. 荧光观察避光：染色样本全程避光，LED 荧光亮度由低到高调节，避免强光长时间照射导致荧光淬灭。

2. 聚光镜适配规范：多层细胞工厂必须将聚光镜摆出（172mm 工作距离），否则物镜触碰培养容器造成设备损伤。

3. 物镜保护：载物台凹槽设计可阻挡培养液溅落物镜，若液体滴落物镜，立即用无尘镜头纸擦拭。

4. 长时间活细胞动态观测：降低荧光 LED 亮度，缩短单次曝光时间，LF200 低毒 LED 光源可支持 0.5–2h 连续动态拍摄，无明显细胞光毒性。

5. 通道切换逻辑：电动荧光盒支持软件联动控制，批量多孔板检测可设置通道自动轮换，提升高通量样本检测效率。

五、方案对比优势（Calcein AM-PI 法搭配 LF200 vs AOPI 法）

1. 细胞安全性：Calcein AM 低细胞毒性，染色后细胞可继续培养；AO 具有遗传毒性，染色样本不可复用，LF200 长时成像仅适配 Calcein AM-PI 体系。

2. 成像维度：Calcein 标记细胞质，LF200 大视场可同步观察细胞形态 + 活力；AO 仅标记核酸，碎片、凋亡小体易造成计数干扰。

3. 样本兼容性：LF200 超长工作距离支持细胞工厂、3D 球原位 Calcein 染色成像；AOPI 多用于悬浮细胞快速计数，不适合厚层立体样本。

4. 实验拓展：LF200 五通道荧光模块可叠加 DAPI 核染，实现 Calcein/PI/DAPI 三色共定位，拓展凋亡、共培养细胞检测。

六、应用场景

本套 LF200+Calcein AM-PI 方案广泛适用于：

1. 药物细胞毒性、抗肿瘤药物筛选；

2. 干细胞、原代细胞活力鉴定；

3. 3D 细胞球、类器官、细胞工厂高通量活力检测；

4. 细胞缺氧、氧化应激损伤模型评价；

5. 科研院所、高校细胞生物学实验室、药企药效评价平台。

七、设备配置清单（LF200 电动荧光标准配置）

1. LF200 无限远校正倒置荧光显微镜主机

2. 45° 铰链式双目镜筒，WF10×/22mm 大视场目镜

3. 长工作距离平场相差荧光物镜：4×、10×PH、20×PH、40×PH

4. 旋转摆入式长工作距离聚光镜（48–172mm 可调）

5. 转盘式相差模块（10/20/40× 相衬环）

6. 电动五通道 LED 荧光激发盒（标配 FITC/TRITC/DAPI）

7. 多功能柔性移动载物台 + 全套培养皿 / 多孔板托板

8. 2100 万高灵敏度荧光显微相机 + 成像分析软件

9. 5W 可调暖色透射 LED 照明系统

莱特 LF200 倒置荧光显微镜依托超长工作距离、电动多通道 LED 荧光、大视野人体工学光学系统、一体化数码成像四大核心硬件优势，匹配 Calcein AM-PI 活死细胞双色染色原位成像需求，整套方案实现样本原位染色→相衬定位→双通道荧光采集→细胞活力定量分析全流程标准化操作，兼顾高通量培养容器、3D 立体细胞样本、长时间活细胞动态观测场景，相比进口倒置荧光设备具备高性价比、国产化售后、软件终身免费升级等优势，是细胞活力检测实验的一站式成像解决方案。